#paper doi:doi/full/10.1002/adfm.202010747 Thymus Extracellular Matrix-Derived Scaffolds Support Graft-Resident Thymopoiesis and Long-Term 胸腺细胞外基质衍生的支架支持移植后的胸腺造血和成年胸腺上皮细胞的长期体外培养 在这项研究中，开发了一种基于脱细胞胸腺组织细胞外基质的三维支架，命名为TS。当播种胎儿或成人胸腺组织时，TS可以以不同的效率支持淋巴前体的成熟，使其成为能够对有丝分裂刺激作出反应的常规和调节性T细胞。 一个功能性胸腺微环境的成功工程，关键取决于成年TEC的体外生长。然而，保存细胞的胸腺造血能力是在体外创建胸腺类器官的主要缺陷之一。因此，这种能力构成了一个关键的困难，需要有效地解决，以建立、研究和操纵T细胞的发展，无论是为实验研究开发一个体外平台，还是为体内替代工作开发一个器官。尽管在结构和细胞条件方面缺乏优化，可能反映在结果的稳健性相当有限，但我们的结果首次描述了允许成年TEC在体外和体内长期生存的工程条件，同时支持胸腺造血。 除了改善TS的工程之外，还需要努力确定具有长期再增殖潜力的TEC前体，能够产生所有的TEC谱系和亚群。来自小鼠TEC的单细胞转录组数据的使用揭示了TEC亚型的相当复杂性，并为确定这些细胞的发育轨迹的计算工作提供了依据。在适当的TS上长期重新填充TEC前体，将确保维持一个能够吸引血源性T细胞前体的环境，并在很长一段时间内指导他们分化和选择成熟的常规和调节性T细胞。在体外培养后，需要改进细胞检索的协议，以便对TEC进行深入的表型和定量调查。由于这些TEC前体很可能是脆弱的，因此需要部署一些条件，以保证有效、迅速和均匀地播种到ECM支架上，并允许用额外的基质细胞（包括间质细胞和内皮细胞）来补充这些基本环境，已知这有助于胸腺交叉对话。使用灌注式生物反应器和选择性条件将进一步帮助在体外创造一个自我组织的胸腺微环境，提供强大的持续T细胞输出。精确控制调节体外胸腺组织形成的化学物理条件对于可重复性和扩展性至关重要，无论是生成较小的器官用于药物筛选，还是生成较大的微环境用于器官替代策略，作为对无胸腺或胸腺发育不全者的治疗选择。 免疫治疗的核心问题： 让免疫系统恢复工作能力，目前的CarT CARNK等等 都是属于治标 如何恢复治本是全世界目前的前沿聚焦方向，也许中医真的可以发挥一些东西。 但是器官再造面临了太多挑战： 1. 类器官作为新型的药筛模型，成本虽然较PDX更低，但还是远高于细胞系。类器官成本占比较高的包括培养使用的基质胶，常用的基质胶为美国BD Biosciences公司的Matrigel，在行业内处于较为垄断的地位，价格较高。Matrigel可以产生类似于哺乳动物细胞基底膜的生物活性基质材料，帮助多种类型的细胞达到附着和分化。Matrigel的来源是小鼠肉瘤细胞系，除了成本较高的问题，同时批次间存在一定的变异性。且由于是动物来源，对于有机类的药物的检测有局限性。考虑到小鼠来源的细胞外基质对于药物筛选实验结果存在一定的干扰，因此基质的工程技术开发用于合成外源差异较小的、非动物来源的基质胶用于成本下降和性能优化将是类器官产业化需要解决的关键性问题之一。基质胶以外，培养也涉及多种细胞因子组合使用，细胞生长因子通常也价格不菲。选择效果更好的细胞因子以及尝试减少使用细胞因子的数量也可以带来成本下降的空间。 2. 目前大多类器官本身并不具备血管化的结构。因此，随着类器官体积的增长，类器官受限于氧气的缺失以及代谢废物的增加，可能导致的组织坏死。已有研究构建血管内皮细胞微环境的肿瘤类器官，将类器官肿瘤细胞和血管内皮细胞在Matrigel上共同培养，生成血管结构以期解决类器官血管化缺失的问题。 3. 血管化以外的难点还包括模拟肿瘤和免疫环境的相互作用关系。2019年Nature Protocol发表了肿瘤类器官和免疫细胞共同培养的相关protocol，可以体现和模拟出肿瘤微环境的部分特征。以上皮类器官和免疫细胞共培养模型为例，可通过在培养基中添加活化的免疫细胞、在组织消化成单细胞后和免疫细胞共同生长、添加ECM中的重组细胞因子等方法重塑类器官和免疫细胞的相互作用。 4. 相比于单个类器官，类器官系统的构建能够对药物疗效和潜在毒性做出更完整全面的评估。目前类器官仅能检测出药物对于肿瘤的抑制效果，对于其他器官组织是否存在其他副作用和安全性风险并不能做出预判。为了解决这一问题，2017年Skardal et al.构建了有心脏、肺部、肝脏组成的集成于闭合循环关注体中的类器官系统，以达到全面揭示药物对不同器官的毒性和药效的目的。 5. 重复性(reproducibility)和一致性 (consistency)也是类器官发展的重大瓶颈，这很大程度上由于过程控制的欠缺与行业标准的空白。类器官培养过程中人为因素的过多参与、自动化程度低导致因为系统偶然性造成的误差较大。同时，类器官检测手段十分匮乏，活体观察主要集中在形态学观察，断点观察集中在基于荧光的各类指标的检测，能够活体实时对类器官各项指标进行检测的光学、电化学等手段仍较为欠缺。当前，类器官很多研究者致力于制造更新的类器官，做出之前未能做出的类器官，我们可以制作海马体、垂体、腺体、脾、肾的类器官，却难以确定一个符合要求的类器官需要满足那些个体的诸如尺寸、形状、基因表达量等，群体的诸如类器官之间的方差等统计学指标。这将限制类器官的高效研究与向临床研究的转化。 6. 对于类器官培养过程中的工程控制也是亟待解决的问题。当前类器官培养大多使用Matrigel水凝胶作为培养基质，Matrigel是康宁生命科学公司生产的Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)小鼠肉瘤细胞分泌的胶状蛋白混合物。Matrigel因其含有外源成分，难以应用在人的很多治疗场景。另一方面，虽然类器官与微流控技术已有一些结合研究的例子，但使用微流控芯片对类器官生存的流体环境进行模拟仍不成熟，如何使用微流控等技术对类器官培养时流体微环境进行控制是亟待解决的问题。同时，现有类器官的直径约在100-500μm之间，虽然具有一定程度的尺度效应，但还是难以模拟真实组织、器官的场景。倘若要制造尺度更大的类器官，类器官的血管化也是十分重要的问题。